Новости
Библиотека
Таблица эл-тов
Биографии
Карта сайтов
Ссылки
О сайте


Пользовательского поиска




предыдущая главасодержаниеследующая глава

Иммобилизация и стабилизация электронотранспортной цепи хлоропластов

В работах [511, 514] исследовано влияние различных факторов среды и иммобилизации на процесс необратимой инактивации, характеризуемый константой λ2, с целью изучения возможности значительной стабилизации электронотранспортной цепи.

Следует различать внешнюю и внутреннюю иммобилизацию сложных биологических структур, таких как клетки микроорганизмов или органеллы. При внешней иммобилизации органеллы и клетки заключаются в гели и (или) химически "пришиваются" к различным поверхностям, так что они теряют подвижность как целые структурные единицы. При внутренней иммобилизации или фиксации обработка бифункциональными или полифункциональными реагентами приводит к ограничению внутриклеточной или внутриорганельной подвижности белков или биомембран.

По внешней иммобилизации хлоропластов имеется лишь несколько работ. Проведенное в работе Китайема и Батлера [515] микрокапсулирование хлоропластов показало, что в процессе иммобилизации происходит значительная инактивация хлоропластов" и только фотосистема I сохраняет до 30% своей активности. Иммобилизация хлоропластов в полиакриламидные гели понижает активность фотосистемы I и фотосистемы II до 10% [516].

В нашей лаборатории проведено большое число экспериментов по иммобилизации изолированных хлоропластов. Хлоропласты иммобилизовали в полиакриламидный гель различного состава, гель, образуемый при обработке желатины или бычьего сывороточного альбумина глутаровым альдегидом, желатиновый и агар-агаровый гели. В общем случае происходит инактивация хлоропластов, при этом система разложения воды (фотосистема II) инактивируется в первую очередь. Лишь в случае агар-агарового и желатинового гелей удается сохранить достаточную активность обеих фотосистем.

На рис. 51 представлена зависимость скорости фотовосстановления ферроцианид-иона от концентрации субстрата для иммобилизованных и неиммобилизованных хлоропластов. Реакцию проводили при насыщающих интенсивностях света, рН-статически оттитровывая протоны, образующиеся при фотоокислении воды. В случае неиммобилизованных хлоропластов реакция протекает в насыщении по субстрату. Зависимость скорости от концентрации субстрата для иммобилизованных хлоропластов интерпретируется как проявление диффузионного сопротивления массопереносу субстрата [514].

Сравнение pH-зависимости максимальной скорости для иммобилизованных и неиммобилизованных хлоропластов (рис. 52) показывает, что иммобилизация приводит к сдвигу максимума активности на 0,6 единицы в сторону низких значений pH. Подобное смещение pH-профиля в реакции Хилла наблюдали ранее [517, 518] при "старении" и инактивации хлоропластов. В табл. 31 приведена зависимость константы скорости необратимой инактивации иммобилизованных хлоропластов от "жесткости" агар-агарового геля. Видно, что при иммобилизации наблюдается незначительная стабилизация электронотранспортной цепи, при этом хлоропласты наиболее стабильны в более "мягких" гелях.

Рис. 52. Влияние pH на активность электронотранспортной цепи изолированных хлоропластов: 1 - нативные хлоропласты; 2 - хлоропласты, иммобилизованные в 3%-ном агар-агаровом геле. Условия: 20% глицерина; 50 мМ хлористого натрия; 22°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 2 мг/л хлорофилла
Рис. 52. Влияние pH на активность электронотранспортной цепи изолированных хлоропластов: 1 - нативные хлоропласты; 2 - хлоропласты, иммобилизованные в 3%-ном агар-агаровом геле. Условия: 20% глицерина; 50 мМ хлористого натрия; 22°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 2 мг/л хлорофилла

Таблица 31. Зависимость константы скорости необратимой инактивации электронотранспортной цепи изолированных хлоропластов от концентрации агар-агара в геле
Таблица 31. Зависимость константы скорости необратимой инактивации электронотранспортной цепи изолированных хлоропластов от концентрации агар-агара в геле

Инактивационные процессы протекают, по-видимому, во внутренней мембране хлоропластов, на которую не оказывает влияния полимерная матрица. В этом плане интересно исследование внутренней иммобилизации хлоропластов.

В литературе имеются исследования качественного характера по изучению влияния бифункциональных реагентов на активность электронотранспортной цепи хлоропластов [519-523].

В рамках кинетической модели (3.103) нами было проведено исследование зависимости величины λ2 от концентрации глутарового альдегида при предварительной обработке хлоропластов и от времени фиксации (рис. 53). Полученные экспериментальные данные позволяют сделать следующие выводы.

Рис. 53. Стабилизация электронотранспортной цепи изолированных хлоропластов фиксацией глутаровым альдегидом; 1 - зависимость Я2 от концентрации альдегида при времени фиксации 30 мин; 2 - зависимость Я2 от времени обработки хлоропластов 0,2%-ным раствором глутарового альдегида. Условия фиксации: 0,4 М сахароза; 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлористого натрия; pH 7,8; 22°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 90 мг/л хлорофилла. При исследовании кинетики инактивации хлоропласты инкубировали в том же буфере при 32°С
Рис. 53. Стабилизация электронотранспортной цепи изолированных хлоропластов фиксацией глутаровым альдегидом; 1 - зависимость λ2 от концентрации альдегида при времени фиксации 30 мин; 2 - зависимость λ2 от времени обработки хлоропластов 0,2%-ным раствором глутарового альдегида. Условия фиксации: 0,4 М сахароза; 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлористого натрия; pH 7,8; 22°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 90 мг/л хлорофилла. При исследовании кинетики инактивации хлоропласты инкубировали в том же буфере при 32°С

1. Обработка хлоропластов глутаровым альдегидом существенно инактивирует электронотранспортную цепь, при этом степень ингибирования начальной активности зависит от концентрации фиксирующего агента и продолжительности обработки. Эти данные согласуются с качественными результатами, полученными в работе [521].

2. Обработка хлоропластов глутаровым альдегидом приводит к стабилизации электронотранспортной цепи, уменьшению константы λ2. Как следует из данных рис. 53, увеличение концентрации или времени обработки фиксирующим агентом дает один и тот же предельный эффект стабилизации.

Снижение эффективности процессов электронного транспорта в фиксированных хлоропластах может быть связано как с дезорганизацией в процессе обработки пигментных систем [521], так и с понижением конформационной подвижности реакционных центров за счет образующихся при фиксации сшивок. С другой стороны, ингибирование электронотранспортного процесса можно объяснить непосредственным взаимодействием глутарового альдегида с ферментами - переносчиками электрона [523].

Наиболее значительные эффекты стабилизации электронотранспортной цепи получены при изучении влияния среды на кинетику инактивации хлоропластов. На рис. 54 приведены данные по зависимости параметра от концентрации глицерина в инкубационной среде. Видно, что глицерин заметно стабилизирует электронотранспортную цепь, при этом кривая проходит через минимум; очень высокие концентрации глицерина не влияют на начальную активность хлоропластов, однако заметно ускоряют их инактивацию.

Рис. 54. Стабилизация электронотранспортной цепи хлоропластов глицерином. Зависимость параметра Я2 от концентрации глицерина. Условия инкубации: 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлористого натрия; pH 7,8; 35°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 80 мг/л хлорофилла
Рис. 54. Стабилизация электронотранспортной цепи хлоропластов глицерином. Зависимость параметра λ2 от концентрации глицерина. Условия инкубации: 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлористого натрия; pH 7,8; 35°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 80 мг/л хлорофилла

Инертные белки, прежде всего бычий сывороточный альбумин, часто используют в качестве стабилизаторов биологических структур. Нами исследована зависимость кинетики инактивации хлоропластов от концентрации в системе бычьего сывороточного альбумина. Добавление в систему BSA существенно стабилизирует электронотранспортную цепь хлоропластов. На рис. 55 приведена зависимость, которая, как и для глицерина, имеет экстремальный характер. Максимальная стабильность хлоропластов наблюдается при 0,1 мМ альбумина.

Рис. 55. Стабилизация электронотранспортной цепи хлоропластов альбумином. Зависимость параметра от концентрации бычьего сывороточного альбумина. Условия инкубации хлоропластов: 40% глицерина; 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлорида натрия; 10 мМ ЭДТА; pH 7,8; 35°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей содержанию 110 мг/л хлорофилла
Рис. 55. Стабилизация электронотранспортной цепи хлоропластов альбумином. Зависимость параметра от концентрации бычьего сывороточного альбумина. Условия инкубации хлоропластов: 40% глицерина; 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлорида натрия; 10 мМ ЭДТА; pH 7,8; 35°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей содержанию 110 мг/л хлорофилла

Концентрация ионов водорода - важный фактор, определяющий стабильность биполимерных структур. На рис. 56 приведены pH-профили параметра λ2 для исходных хлоропластов (кривая 1), хлоропластов, стабилизированных оптимальной концентрацией глицерина (кривая 2) и альбумина (кривая 3). Максимум стабильности для всех трех кривых наблюдается около pH 7,0.

Рис. 56. Зависимость логарифма Я2 от pH (инструментальное значение). Условия инкубации хлоропластов: 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлорида натрия; 35°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 120 мг/л хлорофилла. 1 - 3,7% глицерина; 2 - 40% глицерина; 3 - 40% глицерина, 0,1 мМ БСА
Рис. 56. Зависимость логарифма λ2 от pH (инструментальное значение). Условия инкубации хлоропластов: 40 мМ фосфата натрия; 10 мМ хлорида натрия; 35°С; хлоропласты в концентрации, соответствующей 120 мг/л хлорофилла. 1 - 3,7% глицерина; 2 - 40% глицерина; 3 - 40% глицерина, 0,1 мМ БСА

Таким образом, детальное исследование процесса, ответственного за инактивацию фотосинтетической активности в хлоропластах, показывает, что этот процесс весьма чувствителен к внешним условиям, которые определяются физико-химическими свойствами среды.

Характерной особенностью инактивации хлоропластов является экстремальный характер полученных зависимостей. Один и тот же компонент может быть как стабилизирующим, так и дестабилизирующим фактором в зависимости от его концентрации. Оптимальные условия: pH 7,0; мМ 40 фосфата; 10 мМ ЕДТА; 0,1 мМ БСА; 40% глицерина. В этих условиях среднее время сохранения хлорелл а ста ми активности равно 360 ч (35°С) по сравнению с 2 ч в контрольном опыте.

Было проведено исследование зависимости параметра λ2 от температуры. Наблюдаемая зависимость характеризуется изломом при температуре ∼35°С. Процесс инактивации существенно ускоряется в области температур 35-50°С. Термодинамические характеристики "высокотемпературной" и "низкотемпературной" инактивации соответственно равны: ΔНвыс = 96 ккал/моль, ΔSвыс = 231 э. е., ΔНнизк = 18 ккал/моль, ΔSнизк = -21 э. е. Существует экспериментальное свидетельство, что при температуре 30°С происходит кооперативный процесс "плавления" мембраны хлоропластов [524]. Это, возможно, один из самых важных факторов, препятствующих дальнейшей стабилизации хлоропластов.

В таблице 32 подведены итоги по исследованию стабильности элементов систем биофотолиза воды. В ней приведены исследованные системы, условия проведения процесса и среднее время работы, которое является общей интегральной характеристикой всех систем (см. уравнение 3.69).

Таблица 32. Средние времена 'жизни' элементов систем биофотолиза воды
Таблица 32. Средние времена 'жизни' элементов систем биофотолиза воды

Таким образом, в настоящее время разработана кинетическая теория инактивации биокаталитических систем, основанная на представлениях о надежности, развитых для описания "старения" физических систем. На основе использования этой теории проведен анализ кинетики и механизмов инактивации элементов систем биофотолиза воды и разработаны методы их существенной стабилизации.

предыдущая главасодержаниеследующая глава



ИНТЕРЕСНО:

Ученые научились наблюдать за сверхбыстрыми химическими процессами

Почему на Западе периодическую таблицу никак не связывают с именем Менделеева

Люминесцентные наночастицы открыли новый этап в истории дактилоскопии

Нобелевская премия по химии присуждена за развитие криоэлектронной микроскопии

Новый метод анализа белков работает в 50 раз быстрее

Создана первая «химическая память» объемом в 1 бит

193 года назад впервые получено органическое соединение из неорганических

Ученые разработали программу, которая высчитывает свойства молекул сложных химических соединений

Самосборкой получены структуры из 144 молекулярных компонентов

Учёные создали нанореактор для производства водорода

Ученые из Швеции создали «деревянное стекло»

Разработан новый метод создания молекул

Японские ученые создали жидкий квазиметалл, застывающий на свету

Нобелевскую премию по химии присудили за синтез молекулярных машин

Новая компьютерная программа предсказывает химические связи

Получены цветные изображения на электронном микроскопе

В упавшем в России метеорите обнаружен уникальный квазикристалл

10 невероятно опасных химических веществ

Создатель «суперклея» Гарри Кувер – химик и изобретатель, автор 460 патентов, самый известный из которых так и не помог ему разбогатеть




© Злыгостев Алексей Сергеевич, подборка материалов, оцифровка, статьи, оформление, разработка ПО 2001-2018
При копировании материалов проекта обязательно ставить активную ссылку на страницу источник:
http://chemlib.ru/ 'ChemLib.ru: Библиотека по химии'