Опыты с ферментами: амилазы

Ферменты ускоряют течение многих химических реакций, но делают это избирательно. У каждого из них своя узкая "специальность", один и тот же процесс ускоряется иногда несколькими ферментами. В этом мы сейчас и убедимся.

Рассмотрим ферменты, разрушающие крахмал с присоединением к его "осколкам" молекул воды, т. е. гидролитические ферменты. Среди них - амилазы, о которых мы уже рассказывали в главе "Опыты с углеводами". Поскольку суть действия таких ферментов вы уже знаете, займемся сразу сравнительными опытами: проверим, как действуют на крахмал амилазы человека и животных.

Источником амилазы человека, как и раньше, будет служить слюна. Амилазы животного происхождения вы найдете в пчелином меде.

Приготовьте сначала пять растворов. Первый раствор: соберите в пробирку около 0,5 мл слюны и разбавьте холодной кипяченой водой в двадцать раз. Второй раствор: очень жидкий крахмальный клейстер (четверть чайной ложки крахмала на стакан воды). Третий раствор: разбавленная водой в двадцать раз аптечная иодная настойка. Четвертый раствор: две-три капли пчелиного меда, разведенные водой в десять раз и тщательно перемешанные. Пятый раствор: половина чайной ложки пищевой соды на десять ложек воды.

На этот раз потребуется девять пробирок. Во все пробирки налейте около 5 мл клейстера. В пробирки 1, 4 и 7 прибавьте пипеткой по 5 капель уксуса, а в пробирки 2, 5 и 8 - столько же раствора соды. В остальные пробирки прибавьте по 5 капель чистой воды. Содержимое всех пробирок перемешайте и в каждую внесите по 10 капель разбавленной слюны.

Через 10 мин в пробирки 1, 2 и 3 прибавьте одну-две капли раствора иода и перемешайте смесь. Наблюдайте за изменением окраски. Еще через 15 мин прибавьте такую же порцию иода в пробирки 4, 5 и 6, а еще через 10 мин - в остальные пробирки. Крахмал и декстрины, как вы помните, дают различную окраску с иодом, и по мере разрушения крахмала амилазой цвет меняется. Так можно судить не только о распаде крахмала, но и о том, какая среда - кислая, нейтральная или щелочная - более благоприятна для этого процесса.

Опыт с пчелиным медом ставится точно так же.

Активность амилаз в разных образцах может сильно колебаться, поэтому, возможно, время гидролиза придется уменьшить или увеличить. Например, в слюне заядлых курильщиков амилазы содержится очень мало.

Для следующего опыта понадобится ячменный солод - проросшие зерна ячменя. Опустите зерна в воду на несколько часов и оставьте их прорастать на блюдце в течение 4-5 дней, каждый день подливая немного воды. Проростки отделите, промойте водой и тщательно разотрите деревянным пестиком или ложкой. Кашицу разбавьте двойным количеством дистиллированной воды и отожмите через плотную ткань в стакан. Такой экстракт содержит два фермента: альфа-амилазу и бета-амилазу. Дополнительной обработкой можно разрушить один из них, чтобы наблюдать действие другого. Альфа-амилазу разрушим нагреванием. К одной части экстракта из ячменя добавьте три части воды, размешайте смесь и нагревайте ее 20 мин на водяной бане при 70 °С, тщательно перемешивая. Охлажденный раствор содержит бета-амилазу.

Теперь, чтобы получить раствор альфа-амилазы, нужно разрушить бета-амилазу кислотой. Около 5 мл экстракта охладите до 2-3 °С в холодильнике или на льду, прибавьте неполную чайную ложку охлажденного уксуса и долейте в пробирку почти доверху холодную воду. Смесь перемешайте и оставьте на 15-20 мин, а затем нейтрализуйте раствор, добавляя порошок мела до прекращения выделения пузырьков. Еще раз размешайте смесь, разбавьте в два раза водой, дайте отстояться и слейте жидкость над осадком в чистую пробирку. На этом подготовка к опыту закончена.

В десять пробирок налейте по 1 мл раствора крахмала и по 9 мл воды. В пробирки 1-5 добавьте пипеткой десять капель раствора альфа-амилазы, в остальные пробирки - столько же раствора бета-амилазы. Содержимое всех пробирок перемешайте. Через 3 мин в пробирки 1 и 6 прибавьте одну каплю раствора иода и размешайте. То же проделайте с пробирками 2 и 7 через 5 мин, 3 и 8 - через 10 мин, 4 и 9 - через 20 мин, 5 и 10 - через 30 мин.

Вы заметите, что в присутствии альфа-амилазы окраска быстро меняется: синяя - фиолетовая - родовая - желтая; при этом образуются декстрины - бсколки молекул крахмала. Бета-амилаза действует иначе: она как бы "откусывает" кусочки от молекул крахмала, и поэтому окраска с иодом остается синей, но по мере распада крахмала ее яркость уменьшается.

Результаты этого опыта наглядно показывают разнообразие свойств даже у похожих ферментов. В живых организмах ферменты обычно действуют совместно. Происходящие при этом превращения намного сложнее тех сравнительно простых реакций, которые вы наблюдали в пробирках. Но познание простого - это первый шаг к познанию сложного.