Стационарная кинетика окисления кислородом субстратов - доноров электрона

Была исследована кинетика окисления кислородом двух субстратов неорганического ферроцианид-иона и органического соединения - гидрохинона. При этом изучалась зависимость скорости гомогенного окисления в растворе от концентрации фермента, субстратов, ионов водорода. Кинетическое поведение системы характеризуется следующими закономерностями.

1. Зависимости начальной стационарной скорости реакции от концентрации доноров электрона имеют вид функции с "насыщением" и могут быть охарактеризованы величинами k_кат и К_М. При этом значения k_кат для двух субстратов различной природы практически совпадает (рис. 87).

Рис. 87. Зависимость от pH параметров стационарной скорости окисления ферроцианида калия (●) и гидрохинона (○) кислородом в присутствии лакказы: 1 - lg k_кат; 2 - lg K_М, 25°С; 0,05 М фосфата натрия; 0,05 М ацетата натрия

2. На рис. 87 приведена зависимость k_кат и К_М от pH для обоих субстратов. Значение k_кат контролируется ионогенными группами с рK_а ∼ 5,5, при этом тангенс угла наклона pH-зависимости в елочной области pH равен 2. Величины К_М в исследованной области pH не зависят от концентрации ионов водорода.

Для объяснения этих закономерностей - "михаэлисовской" зависимости скорости от концентрации доноров различной природы с постоянным значением k_кат для разных субстратов и рН-зависимости реакции необходимо ввести ряд новых усложнений в кинетический механизм реакции. Детальный анализ большого числа кинетических схем показывает, что "михаэлисовская" зависимость скорости реакции от концентрации донора, приводящая к величине k_кат практически независящей от природы донора электрона, в рамках рассмотренных выше постулатов, возможна в механизме процесса с участием внутримолекулярной стадии изменения активного центра фермента.

Рассмотрим механизм электрохимического восстановления кислорода с точки зрения реакции окисления вводящихся в раствор органических и неорганических доноров электрона. Переход от электрохимической кинетики, характеризуемой константой k(φ), к процессу, протекающему в растворе, осуществляется, если положить, что стадии электрохимического восстановления активного центра в растворе представляют собой бимолекулярные стадии донирования электронов (k(φ) = k[D]). Это предположение экививалентно постулату о том, что механизм катализа в случае восстановления кислорода химическими донорами и электронами электрохимическим путем один и тот же.

Однако рассмотренная группа механизмов реакции, согласующаяся с экспериментальными электрохимическими данными, не описывает кинетику процесса гомогенного окисления. Анализ кинетических механизмов приведен в табл. 39. Предполагая, что k(φ) соответствует k₁[D], процесс двухэлектронного восстановления, характеризуемый k(φ), в гомогенном случае представляет собой две последовательные стадии k₂[D], k₃[D] (ферроцианид-ион - одноэлектронный донор), можно видеть, что скорость реакции для всех механизмов - линейная функция концентрации донора электронов.

Таблица 38. Кинетические параметры реакций, включающих две стадии протонирования и равновесную стадию переноса электрона

Аналогично можно рассмотреть различные группы механизмов и показать, что "михаэлисовская" зависимость скорости реакции от концентрации субстрата может наблюдаться лишь в условиях участия в механизме реакции внутримолекулярной стадии.

Введение в механизм реакции внутримолекулярной стадии приводит к зависимости скорости реакции, описываемой классическим уравнением Михаэлиса. В табл. 39 приведены простейшие механизмы, включающие стадии присоединения протона К₁, электрона k₁, кислорода K_S и стадию внутримолекулярного процесса, характеризуемую константой скорости k_T. Каталитические константы по донору и кислороду обозначены соответственно k_D и k_O2, значения констант Михаэлиса - К_D и K_O2.

Таблица 39. Кинетические характеристики реакций, включающих стадии протонирования электронного транспорта и мономолекулярной перегруппировки

Таким образом, экспериментально наблюдаемая зависимость скорости реакции от концентрации донора указывает на то, что механизм катализа включает мономолекулярный процесс, протекающий в активном центре фермента на пути превращения кислорода в две молекулы воды. Максимальная скорость реакции при вариации концентрации донора определяется константой скорости этого перехода и (см. табл. 39) не зависит от природы донора. Это согласуется с экспериментальным фактом (см. рис. 87).

Принципиальным является объяснение с точки зрения одной модели pH-зависимости величин k_D и К_D (см. рис. 87). Величина k_D для ферроцианида и гидрохинона зависит от pH и контролируется двумя ионогенными группами с рК 5,5 (в области pH 6-8 ∂ lg υ_макс/∂ pH 2). По-видимому, до скорость определяющей стадии протекают по крайней мере две стадии присоединения протона. В то же время значения К_D для двух исследованных субстратов pH-независимы. Это представляется. достаточно нетривиальным, поскольку pH-функция, входящая в значение k_кат должна также проявляться и в зависимости от pH величины К_M (см. табл. 38, 39).

Анализ показывает, что наблюдаемая pH-зависимость К_M реализуется при компенсации pH-функций, входящих в эту величину. Рассмотрим достаточно общую модель процесса, включающую две кинетические стадии присоединения электрона и одну стадию внутримолекулярного электронного транспорта. При этом предполагается, что лимитирующим стадиям предшествует ряд быстрых равновесных процессов.

(4.57)

В схеме (4.57) индексом А обозначен эффектор, предшествующий первой кинетической стадии, В - второй, С - третьей. Компоненты А, В, С заданы постоянными концентрациями и могут представлять собой ионы водорода, ингибиторы или активаторы фермента. Уравнение скорости для механизма может быть представлено в виде:

(4.58)

где

(4.59)

(4.60)

(4.61)

(4.62)

Соответственно каталитическая константа и константа Михаэлиса, найденные из зависимости скорости реакции от концентрации донора, равны:

(4.63)

(4.64)

В параметр К_D входят лишь константы равновесия и концентрации компонентов, стадий, расположенных между двумя последними кинетическими стадиями k₂ и k_T (см. схему 4.67). На основе уравнения (4.58) можно объяснить независимость К_D от pH в условиях, когда зависимость k_D от pH проявляется достаточно четко. Действительно, при f₂ << k₁/k₂f₁f₃

(4.65)

Если [В] и [С] представляют собой концентрацию ионов водорода и соблюдаются соотношения

т. е. эффективная константа Михаэлиса не является функцией концентрации ионов водорода.

Проведенный анализ pH-зависимости, по-видимому, одно из немногих объяснений наблюдаемого феномена рН-зависимости k_кат и pH-независимости К_М. Можно показать, что сделанные выводы существенно не трансформируются, если в механизм (4.57) добавить еще одну стадию донирования электронов k₃, непосредственно следующую за стадией k₂.

Результаты проведенного кинетического анализа, основанного на изучении электрохимической кинетики катодного восстановления кислорода и на исследовании стационарной кинетики катализа лакказой реакции окисления органических и неорганических доноров электрона, суммирует схема:

(I)

(II)

(III)

(IV)

(V) (4.66)

(VI)

(VII)

(VIII)

(IX)

Стадии (I)-(V) постулированы на основе проделанного электрохимического анализа, стадии (VI)-(IX) можно предположить из анализа данных по кинетике гомогенного окисления лакказой субстратов - доноров электрона. Для гомогенного окисления анализ схемы O₂еррееррт приводит к уравнению скорости

(4.67)

где

(4.68)

(4.69)

Уравнение (4.67) удовлетворяет экспериментальным данным при условиях k₁ << k₃, k₁ > k₂, К₁ = К₃, К₄ = К₂.