Гидрогеназы - катализаторы образования и активации молекулярного водорода

Процессы поглощения или образования водорода в биологических системах протекают с участием специфического класса ферментов, субстратом (или продуктом) которых является молекулярный водород. Эти ферменты получили тривиальное название "гидрогеназы" (1.98.1.1) [168]. Гидрогеназы известны давно, однако в последние годы общенаучный и практический интерес к ферментам этого класса существенно возрос.

Во-первых, водород является простейшей с физико-химической точки зрения молекулярной системой. Гидрогеназы входят в класс полиядерных окислительно-восстановительных ферментов, активный центр которых представляет собой комплекс нескольких ионов металлов. Это общее свойство многих окислительно-восстановительных ферментов, таких как нитрогеназа, церрулолоплазмин, лакказа и др. Детальное исследование механизма активации водорода биологическими катализаторами может существенно продвинуть нас в понимании физико-химических основ ферментативного катализа окислительно-восстановительных реакций и катализа в целом.

Во-вторых, гидрогеназы как катализаторы, активирующие молекулярный водород, весьма интересны с точки зрения инженерной энзимологии. Понимание механизма действия этих ферментов намного облегчает поиск катализаторов реакций гидрогенизации-дегидрогенизации органических соединений - реакций, находящих широкое применение в практике.

В-третьих, особый интерес вызывает возможность использования гидрогеназ в качестве катализаторов в системах биоконверсии энергии. Биоэлектрокатализ гидрогеназами может быть положен в основу получения топливных электродов в электрохимических преобразователях (см. ниже). Наконец, гидрогеназы являются терминальными ферментами в процессе образования молекулярного водорода микроорганизмами. Интерес представляет изучение кинетического поведения гидрогеназ в этих системах. Кроме того, существует возможность создания модельных биохимических систем, осуществляющих фоторазложение воды на водород и кислород (биофотолиз воды).

Гидрогеназы - в достаточной степени распространенные ферменты. В настоящее время известно более 100 микроорганизмов, в которых обнаружены ферменты, проявляющие гидрогеназную активность. Гидрогеназы найдены в микроорганизмах различного таксономического положения: хемотрофные, анаэробные и аэробные бактерии, фототрофные бактерии, зеленые и синезеленые (цинобактерии), бурые, красные, диатомовые водоросли. Данные по микробиологии гидрогеназсодержащих микроорганизмов и метаболизму водорода приведены в работах [174, 283, 284].

Фундаментальная роль гидрогеназы в микроорганизмах, использующих водород, заключается в обеспечении энергетики метаболических процессов за счет окисления водорода. Так, водород-окисляющие микроорганизмы используют водород для восстановления кофакторов с последующим восстановлением СО₂ [285, 286]. Сульфатвосстанавливающие микроорганизмы используют свободную энергию восстановления сульфата до сульфита [287-290]. При выращивании фототрофных бактерий и водорослей в анаэробных условиях в присутствии водорода гидрогеназы обеспечивают возможность фотоассимиляции СО₂ [291-295] и восстановления ряда экзогенно добавленных соединений (нитрат, нитрит, гидроксиламин, бензохинон и др.) [164, 296].

В ряде случаев в клетках имеется достаточно восстановительная среда и создаются термодинамические условия образования молекулярного водорода. Гидрогеназы являются терминальным ферментом в метаболических циклах, приводящих к образованию водорода.

В последние несколько лет значительные успехи достигнуты в биохимическом исследовании гидрогеназ. Появились работы, в которых удалось довести очистку ферментов до электрофоретически однородных препаратов. Практически гомогенные препараты гидрогеназ были получены из Desulfovibrio vulgaris [297, 298], Clostridium pasterianum [299], Chromatium [300], Alcaligenes eutrophus штамм H16 [301], штамм Z = 1 [302], Thiocapsa roseopersicina [303, 304]. В табл. 16 приведены данные по молекулярным весам выделенных ферментов, составу их активных центров, специфическим активностям и на основе этих данных вычислены константы скорости лимитирующих стадий фермент-субстратных превращений в расчете на молекулу белка. Вычисленные величины представляют собой нижние пределы каталитических констант скорости. Как следует из табл. 16, каталитическая эффективность гидрогеназ достаточно высока. Значения k_кат для большинства исследованных ферментов составляют 10² с^-1. Это находится в соответствии с общим статистическим анализом констант скоростей лимитирующих стадий, из которого следует, что величины 10² с^-1 самые распространенные значения k_кат (см. выше).

Таблица 16

Фундаментальная особенность катализа гидрогеназами заключается в том, что все достаточно изученные гидрогеназы содержат активный центр, представляющий собой комплекс ионов железа и ионов неорганической серы S^2-, которая может быть удалена из активного центра в достаточно кислых растворах. На каждую молекулу фермента гидрогеназы обычно содержат 4 иона серы или кратное количество (8Fe²⁺, 8S^2-, Desulfovibrio vulgaris [307] или 12Fe²⁺, 12S^2-, Cl. pasterianum [299]). В этом плане гидрогеназы являются ферредоксин-подобными белками.

Железосульфопротеины - объект достаточно пристального внимания в биохимии [308, 309]. В настоящее время детальному исследованию подвергнуты ферредоксины из различных источников, высокопотенциальные железопротеины из Chromatium и некоторые другие окислительновосстановительные белки. Различными методами, в том числе и методом рентгено-структурного анализа, показано, что ионы железа и серы образуют структуру, так называемый железосерный кластер [310-312] (рис. 13). Структуры такого типа удается получить синтетически. Белковая матрица существенно модифицирует донорно-акцепторные и каталитические свойства кластера. Например, окислительновосстановительный потенциал кластера варьируется от +850 до -480 мВ для белков из различных источников [316, 317]. Можно думать, что у гидрогеназ активный центр ферментов также представлен структурой типа железосерного кластера.

Рис. 13. Структура ферредоксина из Р. aerogenes (А) и негеминового кластера белка Chromatium (Б) по данным рентгеноструктурного анализа

Таким образом, в настоящее время имеется достаточно богатая информация о микробиологии гидрогеназсодержащих микроорганизмов, о биохимических особенностях этого класса ферментов. Однако детального анализа кинетических закономерностей и молекулярного механизма действия гидрогеназ не проводилось. В нашем исследовании основное внимание было обращено на кинетические особенности катализа гидрогеназами.